ω-Transaminases as Promising Biocatalysts for the Chiral Synthesis of β-Amino Acids

Diese Arbeit erörtert die Enzyme-Familie der ω-Transaminasen (ω-TA), die eine stereoselektive Übertragung einer Stickstoffgruppe von einem Amino-Donor auf ein Akzeptor Molekül (mit Keton/Aldehyd-Funktion) katalysieren. ω-Transaminasen sind von großem Interesse für viele pharmazeutische Prozesse und Synthese-Strategien, da selbige es ermöglichen, stickstoffhaltige Wirkstoffe enantiomerenrein zu produzieren. Die Dissertation, angefertigt im Rahmen des vom Bundesministerium für Bildung und Forschung geförderten Projektes Molecular Interaction Engineering (MIE), beschäftigte sich hierbei mit der Enzymherstellung und Modifikation am Beispiel der Synthese von β-Aminosäuren sowie dem Abbau selbiger durch Mikroorganismen. Im Fokus dieser Arbeit stand daher die Transaminierung von β-Ketosäuren/estern, das dafür notwendige Enzym Engineering, sowie die Charakterisierung und Katalogisierung der ω-Transaminase-Familie. Das primäre Ziel war hierbei die Synthese des chiralen Paclitaxel-Bestandteils, β-Phenylalanine(ester), durch ω-Transaminasen demonstrieren. Zusammenfassend konnten in dieser Thesis folgende Punkte erreicht werden: o Die Proteinproduktion und Reinigung der ω-TA aus Variovorax paradoxus konnte durch Codon-Optimierung sowie Fast-protein-liquid-chromatography (FPLC) mittels Ni-NTA-Säulen verbessert werden und die Langzeitstabilität konnte erhöht werden. o Außerdem konnte eine ω-Transaminase-Engineering-Datenbank (oTAED) als hilfreiche Basis für das Transaminase Engineering etabliert werden. o Funktionelle Aminosäurepositionen in der V. paradoxus ω-TA wurden mutiert und die Auswirkungen auf die Aktivität untersucht. o Durch gezielte Mutagenese konnte die Proteinstabilität der ω-TA aus V. paradoxus unter gleichzeitigem Erhalt der Aktivität verbessert werden. o Es konnten die Schwierigkeiten bei der Synthese von β-Phenylalanin (β-PA) durch eine Lipase-ω-TA Kaskadenreaktion erörtert und gezeigt werden. Hierbei wurden alternative Syntheseweg vorgeschlagen und analysiert. o Es wurden zwei ω-TA für die Synthese von (R)- sowie (S)-β-PA-Ethylester identifiziert durch Screening einer ω-TA Bibliothek. o Eine ω-TA (namentlich 3FCR_4M) zeigte Potenzial für eine Maßstabsvergrößerung um den Faktor 200 für die Synthese des (S)-β-PA-Ethylester (200 mL - 30 mM Produktkonzentration). o Der Abbau von β-PA durch zwei Bakterien konnte unter kontrollierten Bedingungen genauer analysiert werden. Dabei wurde erstmals der simultane Abbau beider Enantiomere einer β-Aminosäure durch ein Bakterium gezeigt, wobei neben der Transaminierung noch ein weiterer, bislang unbekannter Abbaumechanismus erfolgt

Editorial

Studierbarkeit und Studienerfolg gehören zu den häufigsten Topoi der Diskussion um Lehre und Studium an Hochschulen im deutschsprachigen Raum, seit mit der Bologna-Erklärung (1999) der sogenannte Bologna-Prozess Fahrt aufnahm. Wir adressieren mit diesem Heft den gesamten Ideenzyklus von der Konzeptualisierung von Studierbarkeit über Analysen bis zur Umsetzung und Steuerung in der Hochschul(politik)praxis

FoldX as Protein Engineering Tool: Better Than Random Based Approaches?

Improving protein stability is an important goal for basic research as well as for clinical and industrial applications but no commonly accepted and widely used strategy for efficient engineering is known. Beside random approaches like error prone PCR or physical techniques to stabilize proteins, e.g. by immobilization, in silico approaches are gaining more attention to apply target-oriented mutagenesis. In this review different algorithms for the prediction of beneficial mutation sites to enhance protein stability are summarized and the advantages and disadvantages of FoldX are highlighted. The question whether the prediction of mutation sites by the algorithm FoldX is more accurate than random based approaches is addressed

Enantiomer discrimination in β-phenylalanine degradation by a newly isolated Paraburkholderia strain BS115 and type strain PsJN

Despite their key role in numerous natural compounds, β-amino acids have rarely been studied as substrates for microbial degradation. Fermentation of the newly isolated Paraburkholderia strain BS115 and the type strain P. phytofirmans PsJN with β-phenylalanine (β-PA) as sole nitrogen source revealed (S)-selective transamination of β-PA to the corresponding β-keto acid by both strains, accompanied by substantial formation of acetophenone (AP) from spontaneous decarboxylation of the emerging β-keto acid. While the PsJN culture became stationary after entire (S)-β-PA consumption, BS115 showed further growth at a considerably slower rate, consuming (R)-β-PA without generation of AP which points to a different degradation mechanism for this enantiomer. This is the first report on degradation of both enantiomers of any β-amino acid by one single bacterial strain

FoldX as Protein Engineering Tool: Better Than Random Based Approaches?

Improving protein stability is an important goal for basic research as well as for clinical and industrial applications but no commonly accepted and widely used strategy for efficient engineering is known. Beside random approaches like error prone PCR or physical techniques to stabilize proteins, e.g. by immobilization, in silico approaches are gaining more attention to apply target-oriented mutagenesis. In this review different algorithms for the prediction of beneficial mutation sites to enhance protein stability are summarized and the advantages and disadvantages of FoldX are highlighted. The question whether the prediction of mutation sites by the algorithm FoldX is more accurate than random based approaches is addressed. Keywords: FoldX, Fold-X, Thermostability, Protein stabilization, Protein engineering, Enzyme engineerin

β-Phenylalanine Ester Synthesis from Stable β-Keto Ester Substrate Using Engineered ω-Transaminases

The successful synthesis of chiral amines from ketones using ω-transaminases has been shown in many cases in the last two decades. In contrast, the amination of β-keto acids is a special and relatively new challenge, as they decompose easily in aqueous solution. To avoid this, transamination of the more stable β-keto esters would be an interesting alternative. For this reason, ω-transaminases were tested in this study, which enabled the transamination of the β-keto ester substrate ethyl benzoylacetate. Therefore, a ω-transaminase library was screened using a coloring o-xylylenediamine assay. The ω-transaminase mutants 3FCR_4M and ATA117 11Rd show great potential for further engineering experiments aiming at the synthesis of chiral (S)- and (R)-β-phenylalanine esters. This alternative approach resulted in the conversion of 32% and 13% for the (S)- and (R)-enantiomer, respectively. Furthermore, the (S)-β-phenylalanine ethyl ester was isolated by performing a semi-preparative synthesi

Enantiomer discrimination in β-phenylalanine degradation by a newly isolated Paraburkholderia strain BS115 and type strain PsJN

Abstract Despite their key role in numerous natural compounds, β-amino acids have rarely been studied as substrates for microbial degradation. Fermentation of the newly isolated Paraburkholderia strain BS115 and the type strain P. phytofirmans PsJN with β-phenylalanine (β-PA) as sole nitrogen source revealed (S)-selective transamination of β-PA to the corresponding β-keto acid by both strains, accompanied by substantial formation of acetophenone (AP) from spontaneous decarboxylation of the emerging β-keto acid. While the PsJN culture became stationary after entire (S)-β-PA consumption, BS115 showed further growth at a considerably slower rate, consuming (R)-β-PA without generation of AP which points to a different degradation mechanism for this enantiomer. This is the first report on degradation of both enantiomers of any β-amino acid by one single bacterial strain